Por las diferencias epidemiológicas, clínicas y etiológicas, el diagnóstico integral de la mastitis debe estar orientado al conocimiento de la prevalencia de la enfermedad en el hato, su etiología y la resistencia bacteriana de los agentes involucrados.
Cuando se conocen todos estos factores se podrán estimar las pérdidas económicas por disminución en la producción, identificar y corregir los puntos críticos que favorecen la difusión de la enfermedad, definir las políticas de tratamiento para evitar cepas multi-resistentes y residuos de antibióticos en la leche.
Para el control de la mastitis bovina es necesario poner en marcha un programa integrado que involucre la salud de los animales, el sistema de manejo durante el ordeño, las condiciones ambientales del alojamiento y del ordeño, las características y condiciones de funcionamiento del equipo de ordeño, el control de los microorganismos causantes y el nivel de capacitación de las personas responsables del ordeño. En un programa de esta naturaleza, el monitoreo semanal con recuento de células somáticas y bacterias es pilar fundamental para definir las acciones a tomar.
En muchas oportunidades se acude al diagnóstico de laboratorio sobre muestras individuales, casi siempre de animales que no han respondido positivamente a uno o varios tratamientos con el objetivo es identificar el agente causante y evaluar in vitro su sensibilidad a los antibióticos, para recomendar un principio activo, que no necesariamente da resultados clínicos favorables debido al tiempo de evolución de la enfermedad y las lesiones de tipo fibroso que caracterizan estos casos crónicos.
Un plan de diagnóstico integral del hato, comprende:
Pruebas de Campo
- Prueba de Mastitis California (CMT).
- Toma de muestras para cultivo microbiológico.
Pruebas de Laboratorio
- Recuento de células somáticas (RCS)
- Cultivos microbiológicos
- Caracterización del microorganismo
- Pruebas de sensibilidad antimicrobiana
Monitoreo
- Recuento de Células Somáticas del tanque (RCS-T)
PRUEBA DE MASTITIS CALIFORNIA (CMT)
Esta es una prueba de campo de fácil manejo y buena sensibilidad que se fundamenta en la capacidad que tiene el reactivo Lauril Sulfato de Sodio para reaccionar con el DNA celular produciendo una viscosidad directamente proporcional al número de células somáticas presentes en la muestra de leche. El reactivo original incluye Purpura de Bromocresol como indicador de pH, virando a azul en leches sanas y tonos de azul oscuro a violeta en casos de lesión de la glándula mamaria (pH alcalino)
Una vez la vaca está lista para ser ordeñada, con pezones limpios y secos, se escurren los 3 ó 4 primeros chorros de leche de cada pezón en los compartimentos de la bandeja apropiada. Se inclina la bandeja en un ángulo de 60º para igualar la cantidad de leche (deben quedar entre 2 y 4 ml de leche). Se agrega una cantidad igual de reactivo y se inicia un proceso de agitación por rotación durante 15 a 20 segundos. Leer e interpretar la prueba.
Los criterios básicos de la interpretación se resumen en la tabla siguiente:
GRADO |
TIPO DE REACCION |
CELULARIDAD/ ml |
NEGATIVO |
La mezcla se mantiene liquida, de color azul. |
< 200.000 |
Trazas |
Mezcla ligeramente viscosa de color azul. |
200.000 - 500.000 |
1 |
Mezcla viscosa no adherida al fondo de color azul oscuro. |
400.000 -1.500.000 |
2 |
Mezcla viscosa que se adhiere al fondo de color violeta |
800.000 - 5.000.000 |
3 |
Mezcla muy viscosa fuertemente adherida que forma un solo grumo de color violeta. |
> 5.000.000 |
El CMT está diseñado para el diagnóstico de mastitis subclínica donde no se observan cambios físicos en las características de la leche y/o de la glándula mamaria. En la práctica en los casos de mastitis clínica la reacción al CMT se califica como grado 4.
El CMT mide indirectamente el número de células somáticas / ml. Normalmente la leche de una glándula mamaria sana tiene menos de 100.000 cél/ml donde el 80% son macrófagos y menos del 20% corresponden a Neutrófilos. Cuando hay inflamación originada en un proceso infeccioso, el número de células somáticas aumenta por el incremento de los Neutrófilos que acuden a cumplir su acción fagocitaria llegando a representar hasta el 90% del recuento de células somáticas.
En la literatura no hay coincidencia sobre el número de células a partir del cual se considera que una glándula mamaria esta afectada de mastitis, pero en términos generales recuentos superiores a 500.000 cél/ml con más del 50% de Neutrófilos se deben considerar como cuadros de mastitis subclínica. Número que se verá incrementado hasta varios millones según la intensidad y extensión de la lesión.
CMT es una prueba que tiene una alta sensibilidad pero presenta algunas deficiencias en especificidad, dando falsos positivos durante la primera semana después del parto y muy especialmente en vacas que tienen más de 7 meses de producción y varios partos. En estos casos el grado de viscosidad es similar en los 4 pezones.
TOMA DE MUESTRA DE LECHE
Las condiciones de toma de muestra de leche son determinantes para el éxito del diagnóstico especialmente para el aislamiento e identificación del agente infeccioso. Previo a la toma se debe lavar, secar y desinfectar muy bien el pezón, escurrir 3 ó 4 chorros y en un recipiente estéril, descargar +/- 5 ml de leche.
Las muestras deben ser transportadas al laboratorio en refrigeración teniendo cuidado que la humedad no altere la identificación de cada tubo en un tiempo no mayor de 36 horas.
RECUENTO DE CÉLULAS SOMÁTICAS
Para el RMD se debe conocer el diámetro del campo microscópico en aumento 100X y con este dato calcular el factor microscópico. Por ejemplo, un microscopio que tenga un campo de 0.140 mm de diámetro en aumento 100X tiene un factor microscópico de 600.000 y uno con diámetro de 0.180 mm tiene un FM de 400.000. La descripción completa del procedimiento esta descrita en el STANDARD METHODS for The Examination of Dairy Products, 16ª Edición.
El procesamiento de las muestras se inicia con una buena homogeneización y luego con asa calibrada se extienden 10µl de leche en un área de 1 cm² en una lámina portaobjetos (caben 5 extendidos por lámina). La fijación se puede ayudar con un flameo sobre el mechero o con aire caliente. Las muestras fijadas se desengrasan con un lavado con Xilol y las láminas se colorean con Azul de Metileno al 1% durante un minuto.
Los frotis coloreados se observan al microscopio utilizando objetivo 100X, y se deben recorrer como mínimo 10 campos en diferentes puntos del frotis. El promedio del número de células por campo se multiplica por el FM y el valor obtenido se reporta como número de células/ml. También es posible hacer la diferenciación morfológica entre macrófagos, células epiteliales y neutrófilos que permita aclarar el diagnóstico según el tipo de células; de igual manera se puede observar la morfología básica de los microorganismos presentes (cocos o bacilos).
ANALISIS BACTERIOLÓGICOS
El objetivo del análisis microbiológico es hacer el aislamiento y caracterización de los microorganismos causantes de la mastitis del hato que permita su agrupación en causantes de:
- Recuento de Células Somáticas del tanque (RCS-T)
- Mastitis originada en la piel de los pezones: Staphylococus no aureus hyicus, S. chromogenes y otros, Streptococcus no agalactiae S. dysgalactiae, S. bovis, S. uberis, entre otros.
- Mastitis ambiental. Escherichia coli, Enterobacter spp, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella spp, Serratia spp, Citrobacter freundii.
- Mastitis iatrogénica. Asociada al uso inadecuado de cánulas intramamarias con la etiología de Mohos ó Levaduras de los géneros: Candida, Cryptococcus y El aspecto cremoso de la secreción láctea, el largo periodo de evolución de la enfermedad, la no respuesta clínica a antibióticos y el uso repetido de los mismos por vía intramamaria son factores que se deben tener en cuenta para sospechar de estos microorganismos.
Todas los agentes causantes de mastitis exceptuando Mycoplasmas sp se multiplican bien en Agar Sangre convirtiéndose en el medio básico para el proceso de aislamiento de los distintos agentes etiológicos. Con el fin de aumentar las posibilidades de éxito del aislamiento y aprovechando las propiedades de la leche como medio de cultivo, las muestras pueden ser preincubadas a 37º C durante 6 a 8 horas antes del cultivo en Agar Sangre. Cuando se toma esta alternativa se debe estar seguro que la muestra ha sido tomada en condiciones asépticas, de lo contrario microorganismos contaminantes van a enmascarar el diagnóstico.
PRUEBAS DE SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA
Por facilidad de manejo y disponibilidad de reactivos, la prueba de sensibilidad antimicrobiana más usada es el método de difusión con discos estandarizado y aceptado universalmente. La selección de principios activos a probar dependerá de la disponibilidad de productos comerciales en el mercado local, la legislación del país sobre uso de antibióticos, el tipo de microorganismo aislado, si es para vaca en lactancia o en el periodo seco y si se va a usar vía parenteral o intramamaria. En una caja de Agar de 100 mm de diámetro se pueden evaluar 7 sensidiscos.
Como guía general se adjunta la clasificación de antimicrobianos según su potencial de distribución en la glándula mamaria y de acuerdo con la vía de aplicación.
En nuestro laboratorio usamos 7 sensidiscos seleccionados de la lista adjunta según el tipo de microorganismo. Tenemos en cuenta el interés particular que tenga el solicitante sobre un determinado principio activo siempre y cuando cumpla con los requisitos farmacológicos, según vía de aplicación.
IDENTIFICACIÓN
|
PRINCIPIO ACTIVO |
BACTERIAS GRAM POSITIVO |
BACTERIAS GRAM NEGATIVO |
AMP |
Ampicilina 10µg |
|
R < 13 S > 17
|
AMX |
Amoxacilina 10µg |
R < 19 S > 20
|
R < 13 S > 18 |
CL |
Cefalexina 30µg |
R < 14 S > 18 |
|
CF |
Cefalotina 30µg |
R < 14 S > 18 |
|
CEQ |
Cefquinome 10µg |
R < 14 S > 18 |
R 14 S 18 |
OB |
Cloxacilina 5µg |
S > 20 |
|
E |
Eritromicina 15µg |
R < 13 S > 23 |
|
ENO |
Enrofloxacina 5µg |
|
S 20 |
GN |
Gentamicina 10µg |
|
R 12 S 15 |
L/MY |
Lincomicina 2µg |
S > 21 |
|
NF |
Neomicina 30µg |
R < 12 S > 17 |
|
P |
Penicilina 10 UI |
R < 28 S > 29 |
|
TE |
Tetraciclina 30µg |
|
R 14 S 19 |
SXT |
Trimetropim 25µl |
|
R 10 S 16 |
CPF |
Cefoperazona 75µg |
R 15 S 21 |
R 15 S 21 |
Clasificación de antimicrobianos según su potencial distribución en la ubre después de la aplicación parenteral o intramamaria:
PARENTERAL
|
INTRAMAMARIA
|
Buena Distribución |
Buena Distribución |
Eritromicina
Tilosina
Espiramicina
Lincomicina
Pirlimicina
Florofenicol
Trimetropin
Oxitetraxiclina
Enrofloxacina
Penetamato
|
Eritromicina
Tilosina
Espiramicina
Lincomicina
Pirlimicina
Florofenicol
Trimetropin
Penetamato
Ampicilina
Amoxacilina
Novobiocina
Enrofloxacina |
Distribución Limitada |
Distribución Limitada |
Sulfametazina
Penicilina G
Ampicilina
Amoxacilina
Cloxacilina
Meticilina
Cefalotina
Cefapirina
Cefuroxime |
Penicilina G
Cloxacilina
Oxacilina
Cefalotina
Cefacetrila
Cepacetril
Cefuroxime
Cetiofur
Cefaperasona
Oxitetraciclina |
Distribución Pobre |
Distribución Pobre
|
Cefalexina
Cetiofur
Cefoperazona
(Dihidro) Estreptomicina
Neomicina
Apramicina
Kanamicina
Amikacin
Gentamicina
Polimixina B
Vancomicina
|
Estreptomicina
Neomicina
Apramicina
Kanamicina
Amikacina
Gentamicina
Tobramicina
Espectinomicina
Aminosidina
Polimixina B
Colistina
Rifaximina |
MONITOREO
El recuento de células somáticas de la leche de tanque RCS - T o de una muestra representativa de todas las cantinas que se producen en la finca, es el mejor indicador para monitorear la situación de mastitis en el hato y estimar las pérdidas por producción. Hay una alta coincidencia en el literatura mundial que un RCS – T menor a 200.000 células / ml es una cifra apropiada para un hato donde la producción no se ve afectada por esta enfermedad y el porcentaje de cuartos afectados por mastitis subclínica es menor del 6%.
Relación entre el RCS-T, el porcentaje de cuartos infectados y el porcentaje de merma de producción
Relación entre el RCS-T, el porcentaje de cuartos infectados y el porcentaje de merma de producción |
RCS –T/ ml |
Porcentaje cuartos infectados |
Porcentajes merma |
< 200.000 |
6 |
0 |
500.000 |
16 |
6 |
1.000.000 |
32 |
18 |
1.500.000 |
48 |
29 |
Para estimar las pérdidas económicas se puede aplicar el criterio de un 2.5% menos de leche producida por cada 100.000 células que aumenten el RCS - T a partir de las 200.000.
Toma de Muestra de Leche para el RCS – T. El grado de homogeneización de las muestras es fundamental para que el recuento sea confiable. Cuando se toma del tanque de enfriamiento se debe encender el agitador como mínimo 10 minutos antes de la toma de la muestra que se recolecta por la parte superior (nunca tomar muestras utilizando el sifón del tanque). Cuando la leche del hato está almacenada en varias cantinas cada una debe ser homogeneizada por agitación fuerte mínimo durante 2 minutos. Con la ayuda de una jeringa o una pipeta se toman cantidades iguales de cada recipiente que se depositan en un frasco limpio para tomar una submuestra previa homogeneización.
La cantidad de muestra y condiciones de transporte dependerá de la técnica que use el laboratorio. Cuando se usa un contador de partículas se toman 5 ml de leche sobre un fijador que entrega el laboratorio y el transporte se hace bajo refrigeración. Para los recuentos microscópicos y contadores automatizados las muestras se deben transportar en agua con hielo a 3º C. Normalmente de las muestras que se envían para análisis microbiológicos se hace el RCS-T.
En muchos países el RCS – T se encuentra incorporado al esquema de pago y se practica una vez a la semana. Algunos procesadores del país ya han incorporado este parámetro en sus esquemas de pago y lo importante para el productor es que se le informe en forma oportuna cualquier variación para tomar acciones de diagnóstico y control.
Bibliografía Consultada y Recomendada
- TREATMENT OF PERACUTE AND ACUTE MASTITIS. Ziv Gideon . The Veterinary Clinics of NOrthamerica. 1. 1.992
- Ganando la lucha contra la mastitis. Philpot, N, Nickerson, S. 002
- Uptdate on Bovine Mastitis. The Veterinary Clinics of Northamerica. 9.3. 993
- Symposium of Bovine Mastitis. The Veteriary Clinics of Northamerica. 2. 1.984
- National Mastitis Council. Annual Meeting Proceedings. Diferentes años.